Bactérias patogénicas em estado viável, mas não cultivável: um desafio para a indústria alimentar

O estado viável, mas não cultivável (VBNC, sigla em inglês para Viable But Non-Culturable) em bactérias patogénicas transmitidas por alimentos, como Salmonella spp. e Listeria monocytogenes, tem vindo a ganhar relevância devido à sua capacidade de escapar aos controlos microbiológicos oficiais e de representar um risco emergente para a segurança alimentar e para a saúde pública.

Através do projeto VBNC-PATHOGENS, a Ainia Centro Tecnológico procura aprofundar o conhecimento sobre os processos produtivos suscetíveis de induzir o estado VBNC na indústria alimentar e desenvolver metodologias específicas para a deteção destes agentes patogénicos.

As doenças transmitidas por microrganismos patogénicos de origem alimentar continuam a constituir um importante problema de saúde pública e de segurança alimentar a nível mundial. Apesar dos controlos microbiológicos estabelecidos pelo Regulamento (CE) n.º 2073/2005 e da vigilância assegurada pelo sistema RASFF, em 2023 os alertas relacionados com agentes patogénicos representaram a segunda categoria de perigo mais frequente nos alimentos (856 notificações), destacando-se Salmonella spp., Listeria monocytogenes e Escherichia coli.

De acordo com a European Food Safety Authority (EFSA), os surtos de origem alimentar aumentaram 43,9 % em 2022 face a 2021, acompanhados de um aumento da mortalidade associada. Em 2024, foram notificados 561 casos de Salmonella spp. e 161 de Listeria monocytogenes, sobretudo em produtos cárneos, peixe, produtos lácteos, frutos secos e sementes, alguns dos quais tradicionalmente considerados de baixo risco devido à sua reduzida atividade de água. Estes dados evidenciam a necessidade de desenvolver novas metodologias que permitam uma deteção mais precisa de microrganismos patogénicos viáveis ao longo da cadeia alimentar.

O estado viável, mas não cultivável (VBNC) representa um desafio significativo. Trata-se de um estado fisiológico de latência no qual certas bactérias se encontram metabolicamente “adormecidas” e são incapazes de crescer em meios de cultura convencionais. Consequentemente, passam despercebidas nos controlos microbiológicos oficiais, que se baseiam maioritariamente no isolamento em meios de cultura seletivos e na realização de contagens em placas, podendo assim integrar a cadeia alimentar e constituir um risco para a saúde do consumidor.

Até à data, foram identificadas 85 espécies bacterianas capazes de entrar no estado VBNC, incluindo 67 espécies patogénicas, como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella e Listeria monocytogenes, entre outras. Estas bactérias representam um perigo considerável e frequentemente oculto na avaliação da segurança alimentar.

No contexto da indústria alimentar, existem numerosos fatores capazes de induzir o estado VBNC durante o processamento e o armazenamento dos alimentos. Estes fatores podem ser de natureza química (por exemplo, determinados reagentes químicos habitualmente utilizados no processamento de alimentos, como a adição de conservantes para prolongar a vida útil, ou a utilização de desinfetantes em instalações e equipamentos industriais) ou de natureza física (como a temperatura, os tratamentos de secagem, a irradiação por luz ultravioleta, os tratamentos por campos elétricos pulsados e luz pulsada, o dióxido de carbono a alta pressão, os tratamentos por plasma, entre outros).

Os principais fatores suscetíveis de reativar bactérias VBNC incluem:

• Aumento da concentração de nutrientes: a adição de um meio de cultura rico foi um dos primeiros métodos utilizados para a ressuscitação de bactérias VBNC.

• Alterações de temperatura: tanto o aumento como a diminuição da temperatura podem desencadear a reativação, especialmente em bactérias induzidas ao estado VBNC por temperaturas extremas.

• Estímulos químicos: determinados compostos químicos podem promover a reativação, como o piruvato de sódio ou a adição de aminoácidos.

• Estímulos biológicos: verificou-se que a cocultura com outras espécies bacterianas, ou mesmo com algumas leveduras, pode induzir a reativação em determinadas espécies. Além disso, proteínas como as Rpf (Resuscitation Promoting Factor) ou determinadas moléculas de sinalização de quorum sensing desempenham um papel crucial neste processo.

• Métodos baseados em biologia molecular: baseiam-se sobretudo na técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), com adaptações específicas para a deteção de células viáveis. Por exemplo, a técnica PMA-qPCR utiliza moléculas que se ligam ao ADN de bactérias mortas e impedem a sua amplificação por PCR, permitindo que apenas as bactérias vivas presentes na amostra sejam detetadas.

• Citometria de fluxo: permite o estudo e a classificação de células individuais em suspensão através da utilização de um laser e de detetores óticos, possibilitando a distinção entre células vivas e não viáveis mediante a utilização de corantes fluorescentes específicos.

• Tecnologias ómicas: permitem avaliar a viabilidade celular através da análise da atividade biológica, como a expressão génica e as vias metabólicas ativas. Entre as suas principais vantagens destacam-se a elevada sensibilidade, a capacidade de detetar múltiplas espécies em simultâneo e a obtenção de informação global sobre o metabolismo e a expressão génica.

O objetivo da Ainia é disponibilizar às empresas da Comunidade Valenciana ferramentas que permitam avaliar o risco e a incidência destas bactérias nos seus produtos e processos, bem como verificar a eficácia dos métodos e produtos de limpeza e desinfeção utilizados. Para esse efeito, o projeto conta com a colaboração de três empresas do setor alimentar e de uma empresa especializada em higiene industrial.

Este projeto é um projeto de I+D+i de carácter não económico, integrado no programa de I+D de um Centro Tecnológico da Comunidade Valenciana, desenvolvido em colaboração com empresas e financiado pelo IVACE+i.